狗是与人类最亲近的动物，也是最难克隆的动物。

世界首例基因编辑克隆犬已在中国诞生。

在不久的未来，定制宠物或将成为现实。

文/记者 白竟楠 编辑 陈永杰

采访专家

赖良学（中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员）

赵建平（北京希诺谷生物科技有限公司常务副总经理）

冯　冲（北京希诺谷生物科技有限公司研究人员）

核心要点

1.“龙龙”的诞生是中国原创的克隆技术

2.目前11种已经被克隆的动物，只有犬的卵母细胞体外成熟效率最低，这也给克隆造成了难度

3.“龙龙”是世界首例通过CRISPR/Cas9技术实现的动脉粥样硬化疾病模型犬的克隆犬

4.克隆犬还有较为广阔的“情感克隆”需求

5.法律并未禁止克隆动物，但实验开展前须经伦理委员会评估

▲世界首例基因编辑的克隆犬——“龙龙” （摄影/白竟楠）

5月28日，我国自主培育首例体细胞克隆犬，也是世界首例基因编辑克隆犬——“龙龙”，在北京西北郊的昌平科技园区诞生。这不仅标志着中国成为全球第二个独立掌握克隆犬技术的国家，也意味着定制宠物或实现。北京科技报记者到“龙龙”的出生地实地进行探访。

犬是最难克隆的一种动物

一看到又有人来参观自己，比格犬“龙龙”和它的代孕母亲都兴奋起来，在笼子又蹦又跳，实验人员将笼子打开，一个半月大的“龙龙”欢天喜地地跑出来玩，没过一会儿，它就跟所有在场的人都熟络起来，扑脚、要抱抱。如果不说，一定不知道，这其实是一只基因编辑克隆犬，它的降生也为中国克隆技术开启了新的篇章。

说起克隆动物，你首先想到的一定是1996年诞生于英国的克隆羊多莉。多莉的诞生让“克隆”这个生僻的专业术语也开始变得广为人知。其后，克隆猴、克隆牛纷纷问世。而犬被认为是最难进行体细胞克隆的动物之一。

2005年世界首例体细胞克隆犬“史努比”在韩国诞生，此后，犬体细胞克隆技术就一直掌握在韩国人手中，从未被其他国家突破。

据北京希诺谷生物科技有限公司研究人员冯冲介绍，克隆犬是世界性难题，面临许多困难：首要问题就是如何获得足够数量的成熟卵母细胞。猪、牛、羊等动物通过体外成熟培养技术可获得大量的成熟卵母细胞，而犬卵母细胞体外成熟培养效率极低，只能从体内获取成熟卵母细胞。体内成熟卵母细胞的获取，需要精确掌握犬发情排卵时间，而一旦错过一次发情排卵时间，需要等上半年或一年才有下一次机会。准确把握排卵时间十分困难，通过血清测定孕激素个体间差异大，难以确立一个统一的评判标准。冲卵时间过早，卵母细胞未成熟;时间过晚，卵母细胞已老化。所以精确掌握犬发情排卵时间，是获取高质量成熟卵母细胞的关键。

其次，一只犬平均排卵7-8枚，排出的卵子处于生发泡期(GV期)，需要在输卵管内停留48-72h到达体外成熟期(MⅡ期)。犬卵母细胞中富含脂类物质，颜色较深，黏性很大，显微操作较困难，体细胞电融合效率不高。

最后，犬胚胎移植中受体与供体间在生殖生理阶段上难以保持一致性。妊娠率低，再加上克隆技术本身的低效率问题，使得犬体细胞克隆更是难上加难，需要投入大量的财力、人力和物力。

▲如何获得足够数量成熟卵母细胞是克隆犬的首个难题

“龙龙”并不是一只简单诞生克隆犬

中国科学院广州生物医药与健康研究院研究员赖良学表示，韩国克隆犬在开发成功之后也发表了论文，但是许多技术环节描述不清晰，按照论文的步骤无法重复实验作出克隆犬。所以，此次“龙龙”的诞生是中国原创的克隆技术。

“都是克隆技术，从技术路线上来说是差不多的，但是具体的技术细节由于韩国的保密措施我们无从知晓，此次成果花费了很多时间和投入才打通了克隆犬的技术路线。我从事克隆动物研究多年，也做过克隆猪。但是狗和其它动物不同，用克隆其它动物的技术参数也是做不出来的。可以说，克隆犬‘龙龙’的实验步骤没有最关键，而是全部都很关键。”赖良学说。

赖良学说：“犬卵母细胞卵黄内含有大量脂肪，使卵细胞在镜下呈现黑色，克隆时需要将供体的卵细胞核移除，而不透明的卵细胞给去核带来了难度。克隆犬的最后一步是移植到代孕犬的子宫中。这需要代孕犬的发情周期和与核移植胚所处的发育阶段同步，由于狗的发情期时间很长，所以代孕犬的子宫环境是否适宜克隆胚胎生长发育难以保证，这造成着床率较低，克隆狗的效率就低了。”

北京希诺谷生物科技有限公司常务副总经理赵建平说，每一个技术环节都很关键，各个环节的难度叠加到一起，更让克隆狗成为一种“难产”的被克隆动物。未来，随着技术的逐步优化，诞生克隆犬所使用的供体和受体数量会下降。

基因编辑模型犬，这个复杂名词到底是什么意思呢?简单来说，就是通过基因编辑技术，使实验犬出生时即带有某种特定疾病。

“龙龙”并不是一只简简单单复制别人家狗的克隆犬，它是世界首例通过CRISPR/Cas9技术实现的动脉粥样硬化疾病模型犬的克隆犬，这只疾病模型犬在2016年12月诞生，被命名为“苹果”。

“苹果”通过CRISPR/Cas9技术敲除载脂蛋白E(APOE)基因，这个基因不表达之后，使犬血液中的脂类代谢发生紊乱，天生患有高脂血症，最终产生动脉粥样硬化的疾病表型。该项成果的取得为研究人类动脉粥样硬化的发病机理及新药研发提供了理想的大动物模型，这是继我国2015年取得狗基因打靶技术突破之后，首次将其应用于人类遗传疾病狗模型的培育。

APOE是血浆脂蛋白的重要组成部分,对脂质在细胞内代谢和分布有重要调节作用,特别是与机体总胆固醇的代谢密切相关。APOE的低表达或缺失将导致血脂含量的升高，从而诱导动脉粥样硬化疾病。

目前，动脉粥样硬化疾病的发病机制及新药物研发尚无合适的犬疾病模型，多利用小鼠为模型进行研究。“苹果”的诞生为动脉粥样硬化疾病的发病机制及新药物研发可以使用大动物疾病模型提供了可能，也就为药物研发提供了更有效的动物实验证据。

冯冲表示，几乎所有的哺乳动物基因测序之后的基因相似度都大于80%，所以用遗传距离来表示物种之间的遗传形状形似度更为准确，也就是从多少年前开始分离物种的。人与狗的遗传距离比人与老鼠的遗传距离更近，一些药物在做完犬的药物试验之后，就可以进入一期临床试验了。

而且，犬在遗传性疾病方面与人类极为相似，约有癌症、心脏病、聋哑、失明和免疫性神经系统疾病等360多种遗传疾病，发病症状与人类临床症状十分相似。此外，犬在新陈代谢、生理学、解剖构造等方面都与人有许多相似之处，这些优势是小鼠及其它模式动物不可替代的，是研究人类许多疾病理想的模式动物。

其实，比格犬作为实验动物已经有几十年的时间，作为一种较常用的模式生物，科研人员对于它的了解难道不足以支撑让克隆犬和疾病模型犬更早几年“出生”吗?

对此，赖良学表示，人类对狗的行为研究和认知研究比较透彻，代谢和生理指标也掌握得较为全面，但是对狗的生殖研究尚不全面，对狗的胚胎体外培养研究等方面都很不成熟。虽然科研人员一直在研究，但是没有得出确切的成果。

▲英国约克郡一对 夫妇劳拉和理查德 花了10 万美元（约 合人民币68 万）克 隆了两只小狗，原 因是思念自己已过 世的爱犬

“基因编辑+克隆”实现定制生物

在人们传统的观念中，克隆就是复制，没有更多的技术意义。其实不然，在当今基因编辑技术火爆的时代，克隆技术能与基因编辑技术结合而发挥更大的作用。

疾病模型动物的生产虽然在犬身上很难实现，以至于作为模式生物多年，狗狗们还是“最初的样子”，但是通过基因编辑制作疾病模型生物已经在小鼠身上广泛应用，制作技术成熟。不同的遗传性疾病可能由不同的基因突变造成，可能是基因丢失，也可能是多余基因的插入，也可能是点突变。

因此，针对不同疾病就要采取基因敲除、基因敲入和点突变等不同编辑模式才能培育出想要的动物模型。在小鼠，通过受精卵注射可以高效培育出基因敲除模型，但基因敲入成功率只有20%，点突变就更难以实现。在犬身上用受精卵注射技术可以实现基因敲除，2015年我国诞生了第一对基因敲除犬。但是要想做基因敲入难度就大了，这时就需要用到克隆技术，当两种技术结合在一起的时候，就可以实现更多的功能。

犬的作用不是停止在实验动物模型水平，它也具备许多辅助人类工作的功能，也就是工作犬。2015年，世界第一只基因敲除犬被选取肌肉生长抑制素基因作为第一个敲除目标基因，该基因对骨骼肌生长具有抑制作用，被敲除后，肌肉生长发育能力增强。只需要获得一对相同基因敲除犬，他们的后代就都会缺少同样的基因，就可以被培养出一支品系，具有发达肌肉的犬更适用于警犬。同时，为定制帕金森症、渐冻人症等疾病研究提供了更合适的疾病模型。

同时，克隆犬还有较为广阔的“情感克隆”需求。2016年，一对英国夫妇养了多年的爱犬死亡，为了让它“复活”，这对英国夫妇支付了十万美元去韩国秀岩研究所克隆了两只一模一样的狗，这也是韩国秀岩研究所第一次在已经死亡八天的犬身上取得了样本。而这样的克隆需求并非个案。

“龙龙”作为一只疾病模型犬的克隆犬，随着它的长大，还会有更多科研成果从“龙龙”身上诞生。希望“龙龙”给我们带来更多的惊喜！■

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